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【摘要】 目的 探讨茶叶防癌的免疫调节机理。方法 用致癌剂4-甲基亚硝胺-1-(3-吡啶)-1-丁酮(NNK)诱发小鼠肿瘤的实验模型，观察NNK所致小鼠免疫功能的改变及绿茶(GT)、复合茶(MT)和茶多酚(TP)的保护作用。结果 小鼠注射NNK后，在观察的4周内，腹腔巨噬细胞吞噬功能、外周血白细胞化学发光、迟发型变态反应、脾细胞抗体生成细胞数、以及脾NK活性等免疫指标，与正常对照组比较均出现不同程度的增高或降低；而GT、MT和TP对所有这些免疫功能的不良改变有明显的保护作用。结论 茶及其成分对NNK诱发小鼠肿瘤过程中早期所致免疫功能的改变具有保护作用。
【关键词】 茶 4-甲基亚硝胺-1-(3-吡啶)-1-丁酮 免疫活性
Protective Effect of Tea on Immune Function in Mice
Zhu Maoxiang, Gong Yifen, Yang Zhihua, et al. Institute of Radiation Medicine Academy of Military Medical Sciences Beijing 100850
【Abstract】 Objective To study the mechanism of preventive effect of tea on cancer by immune regulation. Methods A tumor model was induced in mice using carcinogen, 4-methyl-nitrosoamino-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK), to examine their changes in immune function and the effects of green tea, mixed tea and polyphenol on protection from tumor. Results During the four weeks of observation after injection of NNK into mice, their immunological indicators, such as cytophagocytosis of macrophage in the abdominal cavity, chemiluminescence of peripheral leukocyte, delayed allergic reaction, count of antibody-forming spleen cells and activity of spleen nature killer cells, etc. increased or decreased to various extent, as compared with those in normal controls. It was found that whether green tea, mixed tea or polyphenol all showed significant protection from adverse changes in immune functions. Conclusion Tea and its components had significant protection from early adverse changes in immune function in tumorgenesis induced by NNK.
【Key words】 Tea 4-methyl-nitrosoamino-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK) Immunocompetence
烟草能引起人类多种癌症，特别是与80%以上肺癌发生密切相关［1］。目前已明确的50余种烟草致癌物中包括7种烟草特异亚硝胺，其中4-甲基亚硝胺-1-(3-吡啶)-1-丁酮(4-methylnitrosamino-1-(3-pyridyl)-1-butanone，NNK)最典型，它在烟草中含量高［(1～100)×10-6］致癌性强，被广泛应用于烟草的致癌研究［2］。实验研究证实，NNK可诱发大鼠、小鼠和地鼠等多种动物的肿瘤，尤其以肺癌更为显著［3～5］。茶叶及其成分，如茶多酚、茶色素等，具有抗氧化、抗衰老、抗突变，降血脂及抗癌等多种生物学活性［6］。我们曾报道了绿茶对C57/BL6J小鼠Lewis肺转移癌的抑瘤效果及免疫调节作用［7］。本研究我们用致癌剂量的NNK诱发小鼠，以腹腔巨噬细胞吞噬功能、外周血白细胞化学发光(chemiluminoscence of white blood cells in peripheral blood，WBC-CL)、脾细胞抗体生成细胞数(或称空斑形成细胞，plaque formating cell，PFC)、迟发型变态反应(delayed type hypersensitivity，DTH)以及天然杀伤细胞(natural killer，NK)活性等非特异、体液或细胞免疫的代表性指标，观察小鼠免疫功能在4周内的动态变化规律；同时研究绿茶(green tea，GT)、复合茶(mixed tea，MT)和茶多酚(tea polyphenol，TP)对NNK所致小鼠免疫功能改变的调节作用，进一步为阐明茶叶防癌与免疫调节的关系提供实验依据。
材料与方法 Objective To study the mechanism of preventive effect of tea on cancer by immune regulation. Methods A tumor model was induced in mice using carcinogen, 4-methyl-nitrosoamino-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK), to examine their changes in immune function and the effects of green tea, mixed tea and polyphenol on protection from tumor. Results During the four weeks of observation after injection of NNK into mice, their immunological indicators, such as cytophagocytosis of macrophage in the abdominal cavity, chemiluminescence of peripheral leukocyte, delayed allergic reaction, count of antibody-forming spleen cells and activity of spleen nature killer cells, etc. increased or decreased to various extent, as compared with those in normal controls. It was found that whether green tea, mixed tea or polyphenol all showed significant protection from adverse changes in immune functions. Conclusion Tea and its components had significant protection from early adverse changes in immune function in tumorgenesis induced by NNK.
【Key words】 Tea 4-methyl-nitrosoamino-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK) Immunocompetence
烟草能引起人类多种癌症，特别是与80%以上肺癌发生密切相关［1］。目前已明确的50余种烟草致癌物中包括7种烟草特异亚硝胺，其中4-甲基亚硝胺-1-(3-吡啶)-1-丁酮(4-methylnitrosamino-1-(3-pyridyl)-1-butanone，NNK)最典型，它在烟草中含量高［(1～100)×10-6］致癌性强，被广泛应用于烟草的致癌研究［2］。实验研究证实，NNK可诱发大鼠、小鼠和地鼠等多种动物的肿瘤，尤其以肺癌更为显著［3～5］。茶叶及其成分，如茶多酚、茶色素等，具有抗氧化、抗衰老、抗突变，降血脂及抗癌等多种生物学活性［6］。我们曾报道了绿茶对C57/BL6J小鼠Lewis肺转移癌的抑瘤效果及免疫调节作用［7］。本研究我们用致癌剂量的NNK诱发小鼠，以腹腔巨噬细胞吞噬功能、外周血白细胞化学发光(chemiluminoscence of white blood cells in peripheral blood，WBC-CL)、脾细胞抗体生成细胞数(或称空斑形成细胞，plaque formating cell，PFC)、迟发型变态反应(delayed type hypersensitivity，DTH)以及天然杀伤细胞(natural killer，NK)活性等非特异、体液或细胞免疫的代表性指标，观察小鼠免疫功能在4周内的动态变化规律；同时研究绿茶(green tea，GT)、复合茶(mixed tea，MT)和茶多酚(tea polyphenol，TP)对NNK所致小鼠免疫功能改变的调节作用，进一步为阐明茶叶防癌与免疫调节的关系提供实验依据。
材料与方法 Tea 4-methyl-nitrosoamino-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK) Immunocompetence
烟草能引起人类多种癌症，特别是与80%以上肺癌发生密切相关［1］。目前已明确的50余种烟草致癌物中包括7种烟草特异亚硝胺，其中4-甲基亚硝胺-1-(3-吡啶)-1-丁酮(4-methylnitrosamino-1-(3-pyridyl)-1-butanone，NNK)最典型，它在烟草中含量高［(1～100)×10-6］致癌性强，被广泛应用于烟草的致癌研究［2］。实验研究证实，NNK可诱发大鼠、小鼠和地鼠等多种动物的肿瘤，尤其以肺癌更为显著［3～5］。茶叶及其成分，如茶多酚、茶色素等，具有抗氧化、抗衰老、抗突变，降血脂及抗癌等多种生物学活性［6］。我们曾报道了绿茶对C57/BL6J小鼠Lewis肺转移癌的抑瘤效果及免疫调节作用［7］。本研究我们用致癌剂量的NNK诱发小鼠，以腹腔巨噬细胞吞噬功能、外周血白细胞化学发光(chemiluminoscence of white blood cells in peripheral blood，WBC-CL)、脾细胞抗体生成细胞数(或称空斑形成细胞，plaque formating cell，PFC)、迟发型变态反应(delayed type hypersensitivity，DTH)以及天然杀伤细胞(natural killer，NK)活性等非特异、体液或细胞免疫的代表性指标，观察小鼠免疫功能在4周内的动态变化规律；同时研究绿茶(green tea，GT)、复合茶(mixed tea，MT)和茶多酚(tea polyphenol，TP)对NNK所致小鼠免疫功能改变的调节作用，进一步为阐明茶叶防癌与免疫调节的关系提供实验依据。
材料与方法 烟草能引起人类多种癌症，特别是与80%以上肺癌发生密切相关［1］。目前已明确的50余种烟草致癌物中包括7种烟草特异亚硝胺，其中4-甲基亚硝胺-1-(3-吡啶)-1-丁酮(4-methylnitrosamino-1-(3-pyridyl)-1-butanone，NNK)最典型，它在烟草中含量高［(1～100)×10-6］致癌性强，被广泛应用于烟草的致癌研究［2］。实验研究证实，NNK可诱发大鼠、小鼠和地鼠等多种动物的肿瘤，尤其以肺癌更为显著［3～5］。茶叶及其成分，如茶多酚、茶色素等，具有抗氧化、抗衰老、抗突变，降血脂及抗癌等多种生物学活性［6］。我们曾报道了绿茶对C57/BL6J小鼠Lewis肺转移癌的抑瘤效果及免疫调节作用［7］。本研究我们用致癌剂量的NNK诱发小鼠，以腹腔巨噬细胞吞噬功能、外周血白细胞化学发光(chemiluminoscence of white blood cells in peripheral blood，WBC-CL)、脾细胞抗体生成细胞数(或称空斑形成细胞，plaque formating cell，PFC)、迟发型变态反应(delayed type hypersensitivity，DTH)以及天然杀伤细胞(natural killer，NK)活性等非特异、体液或细胞免疫的代表性指标，观察小鼠免疫功能在4周内的动态变化规律；同时研究绿茶(green tea，GT)、复合茶(mixed tea，MT)和茶多酚(tea polyphenol，TP)对NNK所致小鼠免疫功能改变的调节作用，进一步为阐明茶叶防癌与免疫调节的关系提供实验依据。
材料与方法
一、材料
雌性昆明种小鼠，体重18～20 g，购自军事医学科学院实验动物中心；NNK购自Chemsyn Science Lab(纯度>98%)；51Cr购自Amersham公司；YAC-1细胞由北京劳动卫生研究所赠送；GT(杭州炒青)、MT(绿茶提取物+茶多酚+茶色素)和TP(40%纯度)由中国农业科学院茶叶科学研究所提供；发光增强剂鲁米诺购自Sigma公司；酵母多糖购自上海第二军医大学放射医学教研室；鸡红细胞用健康雄性成年来杭公鸡血制备；绵羊红细胞用健康成年绵羊血制备；豚鼠血清由中国预防医学科学院环境卫生监测所毒理室提供；1640培养基为Gibco公司产品；其余为市售分析纯或优级纯试剂。
二、动物分组
实验动物随机分为正常对照(NC)、NNK对照(NNK-C)、1.0% GT+NNK(NNK+GT)、0.5% MT+NNK(NNK+MT)和0.5% TP+NNK(NNK+TP)5组，每组按不同处死时间又分为若干小组，每小组6只动物左右。
三、NNK配制及注射
按500 μmol/kg剂量称取NNK，加入1～2滴二甲基亚砜(终浓度<2‰)将NNK完全溶解，用生理盐水稀释后，过滤除菌，单次腹腔注射小鼠(每只0.5 ml)。
四、茶水、复合茶和茶多酚的配制
绿茶用沸水浸泡两次(每次20～30 min)，合并两次浸出液配成浓度1.0%的茶水；复合茶和茶多酚用凉开水配成0.5%的溶液；从注射NNK前7天起供小鼠自由饮用；每日更换新鲜茶水、复合茶或茶多酚水溶液，并记录动物饮水量，直至处死。NC和NNK组饮凉开水。
五、观察指标
1.用体内YAC-1细胞清除试验测量小鼠NK活性［8］：将处于指数生长期的YAC-1细胞用51Cr标记，并调整YAC-1细胞浓度为2×106/ml。取0.5 ml细胞悬液用γ计数器测量放射性活性(cpm值)作为注射YAC-1细胞的总cpm值，每鼠经尾静脉注射0.5 ml，1小时后放血处死小鼠，完整取出肺、脾和肝，测量残存的cpm值，用YAC-1细胞的残存百分数表示体内NK活性水平，YAC-1细胞残存率越低，表明NK活性越高。
2.用整体腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的方法评价巨噬细胞功能［9］：实验前2小时腹腔注射0.2 ml 10%鸡红细胞，实验时取出小鼠腹腔液，用电动离心涂片机制片，经风干、固定、染色后，油镜下计数吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数，计算吞噬率(%)。
3.用鲁米诺依赖的酵母多糖刺激法测定WBC-CL［10］：每份样品分别测量基础化学发光(bCL)和激活化学发光(aCL)，用PBS缓冲体系，测量体积1 ml，bCL测量管含0.1 ml血和0.1 mmol/L鲁光诺，aCL测量管含0.1 ml血、0.1 mmol/L鲁米诺和0.1 mg/ml酵母多糖，于37℃测量10秒发光计数，间隔180秒测量一次，连续测量1小时，结果以103个WBC的发光强度(cps/103 WBC)表示。
4.用溶血空斑法(小室法)测定PFC［11］：小鼠腹腔注射0.2 ml 10%绵羊红细胞免疫5天后，取脾脏制成单细胞悬液，计数细胞数，将脾细胞与补体(豚鼠血清)一起于37℃孵育1小时后，计数溶血空斑数，结果用IgM/106脾细胞表示。
5.用足跖厚度增加法测定DTH［12］：小鼠腹腔注射0.2 ml 10%绵羊红细胞免疫4天后，在左足跖部皮下注射20 μl 20%绵羊红细胞，右足跖部皮下注射20 μl生理盐水。次日(20～24小时后)测量左右足跖厚度，用两足跖厚度差值(mm)表示DTH。
六、数据处理
实验数据表示为均数±标准差。用t检验比较各组间均数差异的显著性。
结果
结果
一、NNK对小鼠免疫功能的影响
注射NNK后小鼠免疫功能的变化见表1～7。表1结果表明，与未注射NNK的NC组相比，脾NK活性在注射NNK后1～3天出现应激性增高(YAC-1细胞残存率下降)，7天降低(YAC-1细胞残存率增高)，14天恢复到NC组的水平，但在观察的2周内未发现注射NNK后小鼠肺、肝组织NK活性有明显变化
表1 NNK对小鼠部分器官中NK活性的
影响(
![Image202.gif (850 bytes)]() ±s)
表1 NNK对小鼠部分器官中NK活性的
影响(
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